فهرست مطالب:

چکیده …………………………………………………………………………………………… 1

مقدمه …………………………………………………………………………………………..3

فصل اول کلیات ……………………………………………………………………………….. 5

1-1-پیشینه تاریخی ………………………………………………………………………….. 6

1-2-آماده سازی ال-آسپاراژیناز قابل استفاده برای درمان ………………………………… 8

1-3-  آزمایش های بالینی با ال-آسپاراژیناز ………………………………………………… 10

1-4-خصوصیات شیمیایی و داروشناسی این دارو …………………………………………. 12

1-4-1  اثر ضد سرطانی ………………………………………………………………………. 12

1-4-2- ترکیبات شیمیایی داروی در دسترس برای درمان …………………………………. 14

1-4-2-1 آنزیم طبیعی …………………………………………………………………………. 14

1-4-2-2-آنزیم تغییریافته ……………………………………………………………………… 16

1-5- فارماکوکنتیک …………………………………………………………………………… 19

1-5-1- مقاومت دارویی …………………………………………………………………….. 23

1-5-2-  تأثیر دارویی …………………………………………………………………………. 25

1-6-سمیّت ………………………………………………………………………………….. 28

فصل دوم روش کار …………………………………………………………………………. 34

2-1- مواد و میکروارگانیسم ها ……………………………………………………………….35

2-2- کشت باکتری …………………………………………………………………………… 35

2-3- اعمالUV  در زمان های مختلف ……………………………………………………. 35

2-4- انجام تست Nesslerization به منظور بررسی مقدار آمونیاک آزاد شده ……… 36

2-4-1- کشت کلنی ها ……………………………………………………………………. 36

2-4-2- تعیین غلظت آمونیاک آزاد شده در محلول واکنش توسط ال-آسپاراژیناز کلنی ها….. 37

2-4-3- محلول های لازم برای سنجش میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز کلنی ها…. 38

2-5- استخراج  DNA………………………………………………………………………….

2-5-1- کشت باکتری به منظور استخراج  DNA…………………………………………..

2-5-2- استخراج DNA ژنومی ………………………………………………………………. 41

2-6- واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)   ………………………………………………….. 42

2-7- الکتروفورز بر روی ژل آگارز ……………………………………………………… 43

2-8- خالص سازی محصول PCR …………………………………………………………

2-9- استخراج پلاسمید ……………………………………………………………………. 46

2-10- هضم آنزیمی و کلون کردن قطعه در داخل وکتور ……………………………. 47

2-10-1- الگوی برش آنزیمی ژن ال-آسپاراژیناز ll ……………………………………………

2-10-2- برش و آماده سازی وکتور pET23a(+) ……………………………………….

2-10-3- واکنش الحاق وکتور pET23a(+) با قطعه ژنی ال-آسپاراژینازll  ………….

2-11-ایجاد سلول های Competant و انتقال پلاسمید …………………………….. 49

2-12-انتخاب کلون های مثبت …………………………………………………….. 50

2-13- تأیید کلنی های نوترکیب با PCR و هضم آنزیمی ……………………………. 51

2-13-1-PCR ……………………………………………………………………………

2-13-2- هضم آنزیمی ……………………………………………………………… 52

2-14- بیان و استخراج پروتئین بیان شونده توسط ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll …….

2-14-1- القاء بیان پروتئین آنزیمی ال-آسپاراژیناز  ll………………………………….

2-14-2- استخراج پروتئین های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll  و ال-آسپاراژیناز l ………..

2-15- بررسی اولیه بیان پروتئین نوترکیب ال-آسپاراژیناز ll و پروتئین ال-آسپاراژیناز l با SDS-PAGE……….

 2-16- تعیین فعالیت آنزیمی یا فعالیت کلّی( IU ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……….. 58

2-17- تعیین پروتئین کلّی ( mg ) آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ……………………………. 59

2-18- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژیناز  ………………………… 62

2-19- کشت سلول انسانی  …………………………………………………………….. 62

2-19-1- تهیه محیط کشت RPMI1640 …………………………………………….. 

2-20- تاثیر آنزیم ال-آسپاراژیناز ll (نوترکیب)،ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی انسانی…… 63

2-20-1- MTT Assay ………………………………………………………………

2-21- تست تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………

فصل سوم نتایج ………………………………………………………… 67

3-1- بررسی و شماره گذاری کلنی ها …………………………………….. 68

3-2- نتایج اعداد جذب محلول های استاندارد سولفات آمونیوم در طول موج nm490……

3-3- بررسی اعداد جذب آمونیاک آزاد شده در محلول های به دست آمده از کلنی های جهش یافته…………. 70

3-4- جداسازی و تکثیر ژن آنزیم ال-آسپاراژیناز ll  ……………………………………

3-5- تعیین توالی قطعه ژنی l-aspsraginase ll  …………………………………..

3-6- وارد کردن قطعه ژنی l-asparaginase ll  در وکتور pET23a و تأیید آن …. 76

3-7- نتیجه SDS-PAGE نمونه های آنزیمی ال-آسپاراژیناز ll , l و استاندارد ……. 79

3-8- محاسبۀ فعالیت آنزیمی(IU)  ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد.. 80

3-9- تعیین پروتئین کلّی (mg) آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد……. 82

3-10- تعیین فعالیت ویژه( IU/mg )  آنزیم های ال-آسپاراژینازll نوترکیب، ال-آسپاراژینازl و ال-آسپاراژیناز استاندارد…… 84

3-11- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی HeLa …………….

3-12- بررسی تأثیر آنزیم ال-آسپاراژینازll (نوترکیب)، ال-آسپاراژینازl و آنزیم استاندارد بر سلول های سرطانی LCL…………….

3-13- بررسی تغییرات سیتوپلاسمی سلول های سرطانی بعد از انجام تست MTT ………..

فصل چهارم بحث و پیشنهادات ……………………………………………….. 98 

منابع …………………………………………………………………………………….. 108

برای دانلود پایان نامه اینجا کلیک کنید

لینک بالا اشتباه است

برای دانلود متن کامل اینجا کلیک کنید

       

:: بازدید از این مطلب : 132